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本制品是一种基于钙蛋白酶的催化反应生成荧光物质，通过荧光法，快速、灵敏地检测细胞、组织样品中钙蛋白酶(Calpain)活性的试剂盒。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。本试剂盒可以检测低至约0.03mU/ml的Calpain，在0.03～33.3mU/ml范围内有良好的线性关系。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒对Assay Buffer和试剂用量等条件进行了优化，不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统，可用于小鼠、大鼠、人等的组织或细胞样品的检测，全程约2小时即可完成。

钙蛋白酶是一类依赖钙离子激活的半胱氨酸蛋白酶，能通过有限的蛋白水解调节细胞增殖、分化、细胞骨架重塑、细胞信号传导和细胞凋亡等生理过程。已知至少15种钙蛋白酶亚型，μ-Calpain (Calpain 1，常见于胞质)和m-Calpain (Calpain 2，多与膜结构关联)是两个典型成员，分别是需要微摩尔级钙离子激活和毫摩尔级钙离子激活。钙蛋白酶由含蛋白酶活性结构域、负责切割底物蛋白的催化亚基和帮助结合钙离子并调控酶活性的调节亚基组成，形成异二聚体。钙蛋白酶广泛表达于多种生物体中，包括脊椎动物、无脊椎动物、真菌和细菌等。

本试剂盒检测原理如图1所示。本试剂盒中提供的Calpain底物(Calpain Substrate)带有AFC荧光基团，在钙蛋白酶(Calpain)的水解作用下，钙蛋白酶底物被切割并释放出游离的荧光产物7-氨基-4(三氟甲基)-香豆素(AFC)，这样通过检测AFC的荧光就可以非常灵敏地检测Calpain的酶活性。Calpain的活性与检测所得的荧光强度成正比。AFC的最大激发波长为380nm，最大发射波长为480nm。

图1．钙蛋白酶检测试剂盒检测原理图。

组分	100T	500T
BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay	20mL	100mL
Calpain Assay Buffer	20mL	100mL
AFC Standard(50mM)	50μL	250μL
Positive Control	100μL	500μL
Calpain Cofactor I	200μL	1mL
Calpain Cofactor II	400μL	2mL
Calpain Substrate	100μL	500μL
Calpain Inhibitor(50×)	20μL	100μL

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 本试剂盒提供了Calpain Inhibitor(50×)，可以在样品检测时同时设置添加钙蛋白酶抑制剂的样品背景对照组，样品和样品背景对照孔之间的信号差即为钙蛋白酶催化生成的荧光物质的信号值。
  
• BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay Buffer、Calpain Assay Buffer、AFC Standard (50mM)、Calpain Cofactor I、Calpain Cofactor II和Calapin Substrate需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。Positive Control使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
  
• 如果使用本试剂盒提供的BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在7.4～7.5之间，或者确保样品的pH值在7.4～7.5之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。
  
• 体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
  
• 细胞等裂解样品如果置于4℃保存，用于钙蛋白酶活性检测时，宜在当天完成检测，否则可能会影响检测结果的准确性。通常细胞或组织裂解样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。
  
• 荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，推荐选购黑色96孔板(独立包装，带盖)或黑色透明底96孔细胞培养板(平底带盖)。

本试剂盒提供了钙蛋白酶催化生成的荧光产物的标准溶液(AFC Standard)，可以通过设置标准曲线(图2A)，计算出样品中Calpain活力。

图2.钙蛋白酶检测试剂盒对AFC标准品、阳性对照、小鼠腿肌裂解液样品及与Calpain抑制剂(Calpain Inhibitor)共孵育的阳性对照的检测效果图。图A为本试剂盒检测不同剂量的AFC标准品(0.01～10nmol)的荧光值，10μL各浓度的AFC标准品加入88μL Calpain Assay Buffer和2μL Calpain Cofactor I混匀后，测定荧光强度。图B为本试剂盒检测阳性对照、130μg蛋白量的小鼠腿肌裂解液样品，以及与Calpain Inhibitor共孵育的阳性对照中钙蛋白酶活性的荧光值。阳性对照(Positive Control)和小鼠腿肌裂解液样品(Mouse Muscle)，加入Calpain检测工作液并混匀后，立即测定荧光强度，37℃继续孵育30分钟，期间每5分钟测定一次荧光强度；抑制剂组(Positive Control+Inhibitor)为阳性对照预先与Calpain Inhibitor在37℃孵育10分钟，为模拟样品背景对照。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 样品的准备：
  
  • 贴壁细胞：PBS洗涤一次并吸净残留液体。
    
  • 悬浮细胞：先适当离心(如100～500×g,5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。
    
  • 组织样品：按照每10mg组织加入100μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用组织研磨仪或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。
  • 以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
• 试剂盒的准备：
  
  • 将BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay Buffer、Calpain Assay Buffer、AFC Standard (50mM)、Calpain Cofactor I、Calpain Cofactor II和Calpain Substrate等试剂平衡至室温后分别混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • Calpain Inhibitor(1×)的配制：将Calpain Inhibitor(50×)用Calpain Assay Buffer稀释至1×，例如取1μL Calpain Inhibitor(50×)，加入49μL Calpain Assay Buffer，混匀即得50μL的Calpain Inhibitor(1×)。通常每孔使用5μL。
    
  • Calpain检测工作液的配制：按照每个样品需10μL Calpain检测工作液的比例配制适量的Calpain检测工作液。均匀混合5μL Calpain Assay Buffer、4μL Calpain Cofactor II、1μL Calpain Substrate，即可配制成10μL Calpain检测工作液。根据待检测样品(不包括标准品)的数量，配制适量的Calpain检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Calpain检测工作液可以短暂冰浴避光保存，1小时内较为稳定，但建议尽量现配现用。
    

    样品	1	10	20	50
    Calpain Assay Buffer(μL)	5	50	100	250
    Calpain Cofactor II(μL)	4	40	80	200
    Calpain Substrate(μL)	1	10	20	50
    Calpain检测工作液(μL)	10	100	200	500

• 样品测定：
  
  • AFC标准曲线的设置：取2μL 50mM的AFC Standard，加入98μL Calpain Assay Buffer，混匀，配制成浓度为1mM的AFC Standard溶液。分别取1mM的AFC Standard溶液0、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10μL加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Calpain Assay Buffer补足至10μL (或采用倍比稀释的方式配制标准溶液)，此时，标准曲线的浓度和物质的量分别为0、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1mM或0、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10nmol。
    
    • 也可根据样品中Calpain的大概活性范围，自行设置适宜的AFC浓度进行标准曲线的设置。
  • 取1～10μL样品或稀释后的样品到96孔板样品孔中，并加入Calpain Assay Buffer至样品孔中补足到10μL。同时设置仅含Calpain Assay Buffer的孔为空白对照。
    
    • 为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者样品的量。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了5倍稀释，加入的“稀释后的样品”为2μL，则n=5×10/2=25)。
    • 对于组织裂解液上清等复杂样品，建议将适当样品设置多个稀释倍数进行预实验，在适当的稀释倍数时，样品的信号值和样品中的蛋白量通常会呈现出良好的线性关系。再根据预实验的结果，选取适宜的稀释倍数用于后续的测定，否则即使信号值在标准曲线的线性范围内，也可能无法得到理想的检测结果。
    • (选做)样品中含有的溶酶体蛋白酶可能会对酶活性的检测产生一定的影响，此时可加入Calpain Inhibitor进行确认或作为样品背景对照(见下表)。按照步骤3b加入等体积的样品并补足样品体积至10μL，再加入73μL Calpain Assay Buffer、2μL Calpain Cofactor I和5μL Calpain Inhibitor(1×)混匀后，预先37℃中孵育5～10分钟。后续计算时需要先用对应时间的样品组的荧光值减去样品背景对照孔的荧光值。
  • 参考下表，依次加入样品和各溶液，混匀。然后空白对照孔、阳性对照孔、样品孔和样品背景对照孔各孔加入Calpain检测工作液10μL，混匀。标准品孔无须加入Calpain检测工作液。
    

    成分(μL)	空白对照孔	标准品孔	阳性对照孔	样品孔	样品背景对照孔
    Calpain Assay Buffer	88	88	78	78	73
    Calpain Cofactor I	2	2	2	2	2
    AFC Standard	-	10	-	-	-
    Positive Control	-	-	10	-	-
    样品	-	-	-	10	10
    Calpain Inhibitor(1×)	-	-	-	-	5
    					37℃,5～10min
    Calpain检测工作液	10	-	10	10	10
    总体积	100	100	100	100	100

    • 标准品、样品分别为步骤3a和3b中的10μL体积。
  • 立即使用适当的酶标仪进行荧光检测。激发波长为380nm、发射波长为480nm。此时记录为0分钟读值RFU1。
    
  • 37℃反应30～60分钟，反应时间记为T，测定荧光强度，记为RFU2。信号的增强取决于Calpain催化产生的AFC的量，ΔRFU＝RFU2－RFU1。
    
    • 为取得最佳的检测效果，反应时间可以根据待测样品中的Calpain活性进行调整，但是必须确保读数在标准曲线范围内。对于Calpain活性较高的样品，建议测定总时间为20或30分钟，对应的测定间隔时间设为2或5分钟；对于Calpain活性较低的样品，可以延长测定总时间为1～2小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟。也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取检测数据中前期一段时间内呈现线性的数据用于分析和计算。
    • 如果酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。
  • 建立AFC标准曲线，将ΔRFU代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中Calpain催化产生的AFC的量(记录为A)。Calpain标准曲线可以参考图2A，在0.01～10nmol范围内有良好的线性关系。Calpain Activity的计算公式如下：
    
    Calpain Activity (nmol/min/ml or mU/mL)=A×n/(T×V)
    
    
    • A为步骤3f根据标准曲线确定的AFC的物质的量(nmol)；
      
    • n为步骤3b样品总稀释倍数；
      
    • T为步骤3e的反应时间(min)；
      
    • V为待测样品的体积(V=10μL=0.01mL)。
      
    • 钙蛋白酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit,U)在37℃，pH7.5的条件下，每分钟内可以催化生成1μmol AFC。

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